Redundanz und die Rolle der Proteinkopienzahlen in der Zellpolarisationsmaschinerie von Keimhefe

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 6504 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Wie kann sich eine selbstorganisierte Zellfunktion weiterentwickeln, sich an Störungen anpassen und neue Unterfunktionen erwerben? Um bei der Beantwortung dieser grundlegenden Fragen der evolutionären Zellbiologie voranzukommen, analysieren wir als konkretes Beispiel die Zellpolaritätsmaschinerie von Saccharomyces cerevisiae. Dieses zelluläre Modul weist eine faszinierende Widerstandsfähigkeit auf: Es bleibt unter genetischen Störungen funktionsfähig und erholt sich schnell und reproduzierbar nach der Löschung einer seiner Schlüsselkomponenten. Mithilfe einer Kombination aus Modellierung, konzeptioneller Theorie und Experimenten schlagen wir vor, dass mehrere redundante Selbstorganisationsmechanismen innerhalb des Proteinnetzwerks, das der Zellpolarisierung zugrunde liegt, koexistieren und für die Widerstandsfähigkeit und Anpassungsfähigkeit des Moduls verantwortlich sind. Basierend auf unserem mechanistischen Verständnis der Polaritätsbildung nehmen wir an, dass Gerüstproteine ​​durch die Einführung neuer Verbindungen in das bestehende Netzwerk die Redundanz von Mechanismen und damit die Entwicklungsfähigkeit anderer Netzwerkkomponenten erhöhen können. Darüber hinaus gibt unsere Arbeit einen Ausblick darauf, wie sich aus einer rudimentäreren Vorfahrenform ein komplexes, redundantes Zellmodul entwickelt haben könnte.

Biologische Systeme sind selbstorganisiert. Ihre Funktion entsteht durch das kollektive Zusammenspiel vieler Komponenten – gesteuert durch physikalische und chemische Prozesse. Wie entwickeln sich solche kollektiven (selbstorganisierten) Funktionen und passen sie sich an starke Störungen wie den Verlust wesentlicher Komponenten an1,2?

Ein eindrucksvolles Beispiel für eine solche Anpassung ist die Cdc42-Zellpolarisationsmaschinerie von S. cerevisiae (Knospungshefe). Die Zellpolarisierung steuert die Zellteilung der aufkeimenden Hefe durch die Bildung einer polaren Zone mit hoher Cdc42-Konzentration auf der Membran (siehe Abb. 1a–c). Nach dem Ausschalten von Bem1, einem wichtigen Akteur im Cdc42-Interaktionsnetzwerk (Abb. 1d), gewinnen Zellen durch den Verlust einer anderen Komponente dieses Netzwerks ihre Fähigkeit zur Polarisation und Teilung zurück. Dies geschieht schnell (innerhalb von 100 Generationen) und reproduzierbar3. Wie diese Erholung funktioniert, blieb unklar.

a Ausgehend von einer zunächst homogenen Verteilung von Cdc42 bildet sich eine polare Zone, die durch eine hohe Konzentration an aktivem Cdc42 auf der Plasmamembran gekennzeichnet ist. Es gibt zwei Wege des gerichteten Transports in den Zellen: b Zytosolischer Diffusionsfluss, angetrieben durch einen Konzentrationsgradienten, der durch räumlich getrennte Anlagerungs- (roter Pfeil) und Ablösungszonen (blauer Pfeil) aufrechterhalten wird; c Der Vesikeltransport (endozytisches Recycling) erfolgt entlang polar ausgerichteter Aktinkabel. Aktives Cdc42 steuert sowohl die zytosolische Diffusion (durch die Rekrutierung nachgeschalteter Effektoren, die wiederum Cdc42 rekrutieren) als auch den Vesikeltransport (durch die Rekrutierung von Bni1, das die Aktinpolymerisation initiiert). d Molekulares Interaktionsnetzwerk rund um die GTPase Cdc42, an dem Aktivitätsregulatoren (GEF, GAPs) und das Gerüstprotein Bem1 beteiligt sind (einige Komponenten werden aus Gründen der visuellen Klarheit mehrfach angezeigt, nicht um eine chronologische Reihenfolge zu implizieren). Ein wirksamer Rekrutierungszeitraum erklärt die Cdc42-Rekrutierung an der Membran, die durch Cdc42-GTP gesteuert wird und durch die Interaktionspartner von Cdc42, beispielsweise Cla413,31,73 und Rsr186 (e), erleichtert wird. Einzelheiten des Modells und der mathematischen Implementierung sind in den Methoden und der ergänzenden Anmerkung 1 beschrieben. Der Einfachheit halber berücksichtigen wir Cdc42-Effektor-Komplexe nicht explizit. Eine Modellerweiterung unter Berücksichtigung dieser Komplexe änderte die Ergebnisse nicht wesentlich.

Die Zellpolarisierung von Keimhefe wird durch ein komplexes Interaktionsnetzwerk (Abb. 1d) rund um das zentrale Polaritätsprotein Cdc42 organisiert. Cdc42 ist eine GTPase, die zwischen einem aktiven (GTP-gebundenen) und einem inaktiven (BIP-gebundenen) Zustand wechselt. Die Hauptmerkmale dieser beiden Zustände bestehen darin, dass aktives Cdc42 stark an die Membran gebunden ist und viele nachgeschaltete Faktoren rekrutiert, während sich inaktives Cdc42-GDP von der Membran zum Zytosol lösen kann, wo es frei diffundiert.

In Wildtyp-Zellen (WT) wird die Polarisation durch stromaufwärts gelegene Signale wie die frühere Knospennarbe gesteuert4,5,6,7. Wichtig ist jedoch, dass Cdc42 in Abwesenheit solcher Hinweise spontan in eine zufällige Richtung polarisieren kann8,9,10. Welche elementaren Prozesse liegen der spontanen Cdc42-Polarisation zugrunde? Auf der Zeitskala der Polaritätsfeststellung ist die Gesamtzahl der Proteinkopien der Cdc42-Proteine ​​(sowie ihrer Interaktionspartner) nahezu konstant. Um ein räumliches Muster in der Proteinkonzentration, die sogenannte Polarzone, zu etablieren, müssen die Proteine ​​durch gezielten Transport räumlich in der Zelle umverteilt werden. Es gibt zwei unterschiedliche, meist unabhängige Wege für den gerichteten Transport, die durch experimentelle und theoretische Studien9,10,11,12,13 etabliert wurden: den zytosolischen Diffusionsfluss, der durch einen anhaltenden Konzentrationsgradienten (Ficks Gesetz) angetrieben wird, und den vesikelbasierten aktiven Transport entlang polarisierte Aktinkabel (Abb. 1b, c).

Sobald eine Polarzone etabliert ist, führt der daraus resultierende Konzentrationsgradient auf der Membran zu einem diffusiven Fluss von Proteinen weg von der Polarzone. Um die Polarzone aufrechtzuerhalten, muss diesem Fluss auf der Membran kontinuierlich entgegengewirkt werden, indem die Proteine ​​über einen Fluss vom Zytosol zur Membran10,12,14 oder über einen vesikelbasierten Transport9,11 zurück in die Polarzone zurückgeführt werden. In WT-Zellen rekrutiert Cdc42-GTP Bem1 aus dem Zytosol, das wiederum den GEF (Guanine Nucleotide Exchange Factor) Cdc24 rekrutiert (siehe Abb. 1d)8,15. Der membrangebundene Bem1-Cdc24-Komplex rekrutiert dann mehr Cdc42-GDP aus dem Zytosol und aktiviert es (Nukleotidaustausch)16. Das Markenzeichen und entscheidende Element dieses gegenseitigen Rekrutierungsmechanismus ist die Co-Lokalisierung von Cdc42 und seinem GEF Cdc2410,13,16,17,18.

Die Löschung von Bem1 stört die lokalisierte Rekrutierung und Aktivierung von Cdc4213,18 und beeinträchtigt dadurch erheblich die Fähigkeit der Zellen, sich zu polarisieren und zu knospen8,19. Bem1Δ-Zellen können durch Bem1-Fragmente gerettet werden, die die gegenseitige Rekrutierung von Cdc42 und seinem GEF Cdc24 nicht vermitteln können, sondern lediglich eine erhöhte globale (homogene) GEF-Aktivität verleihen, indem sie die Autohemmung von Cdc24 aufheben20,21,22,23. Noch interessanter ist, dass bem1Δ-Mutanten in der experimentellen Evolution reproduzierbar durch den anschließenden Verlust von Bem33 gerettet werden, einem von vier bekannten Cdc42-GAPs, die die GTP-Hydrolyse katalysieren, dh Cdc42 in seinen inaktiven, GDP-gebundenen Zustand überführen. Diese experimentellen Ergebnisse legen nahe, dass es einen versteckten Cdc42-Polarisationsmechanismus gibt, der unabhängig von der GEF-Co-Lokalisierung ist und entweder durch erhöhte GEF-Aktivität oder den Verlust einer Cdc42-Lücke aktiviert wird.

Hier entwickeln wir ein mathematisches Modell für das Zellpolarisationsmodul von Keimhefe – und fassen dabei die Erkenntnisse aus einer großen Menge experimenteller und theoretischer Literatur zusammen. Unsere theoretische Analyse dieses Modells zeigt, dass das Zellpolaritätsmodul mehrere redundante Mechanismen umfasst, die auf Reaktionsdiffusion und möglicherweise vesikelbasiertem Transport basieren. Es zeigt sich, dass zusätzlich zum Bem1-vermittelten gegenseitigen Rekrutierungsmechanismus ein eindeutiger und latenter Mechanismus in der Cdc42-Polarisierungsmaschinerie existiert. Entscheidend ist, dass dieser latente Mechanismus eine explizite Modellierung des intermediären Cdc42-GAP-Komplexes erfordert, der in früheren Modellen nicht berücksichtigt wurde. Wir zeigen, dass der latente Mechanismus unter anderen Einschränkungen der Proteinkopienzahlen arbeitet als der Wildtypmechanismus und durch den Verlust von Bem3 aktiviert wird, was die Gesamtproteinkopienzahl der GAPs senkt. Dies erklärt, wie die Zellpolarisation in bem1Δ bem3Δ-Zellen3 gerettet wird, und bringt auch die oben dargelegten rätselhaften experimentellen Ergebnisse in Einklang. Darüber hinaus bestätigen wir experimentell die Vorhersagen unserer Theorie, wie die Zellpolarisierung in verschiedenen Mutanten durch Änderung der Kopienzahl des Cdc42-Proteins wiederhergestellt werden kann. Auf der Grundlage des mechanistischen Verständnisses des Zellpolarisationsmoduls in aufkeimenden Hefen schlagen wir dann ein mögliches Evolutionsszenario für die Entstehung dieser selbstorganisierten Zellfunktion vor. Wir formulieren eine konkrete Hypothese, wonach die Evolution Gerüstproteine ​​nutzen könnte, um neue Verbindungen in ein bestehendes Netzwerk einzuführen und so die Redundanz von Mechanismen innerhalb eines funktionellen Zellmoduls zu erhöhen. Diese Redundanz lockert die Beschränkungen des Moduls und ermöglicht dadurch eine weitere Weiterentwicklung seiner Komponenten, beispielsweise durch Duplizierung und Subfunktionalisierung24.

Als Grundlage für unsere theoretische Analyse müssen wir zunächst ein mathematisches Modell der Cdc42-Polarisationsmaschinerie der Zellen formulieren, das in der Lage ist, die Bem1-unabhängige Polarisation zu erklären. Das Zusammenspiel von räumlichen Transportprozessen (Abb. 1a, c) und Protein-Protein-Wechselwirkungen (Abb. 1d) wird im Rahmen der Reaktions-Diffusions-Dynamik beschrieben. Das von uns vorgeschlagene biochemische Interaktionsnetzwerk basiert auf dem in 12 eingeführten quantitativen Modell und erweitert es um mehrere minimale, aber wesentliche Erweiterungen. Das Modell berücksichtigt den Cdc42-GTPase-Zyklus und die Wechselwirkungen zwischen Cdc42, Bem1 und Cdc2410. In Erweiterung bisheriger Modelle beziehen wir explizit die vorübergehende Bildung eines GAP-Cdc42-Komplexes als Zwischenschritt in die enzymatische Wechselwirkung zwischen GAPs und Cdc4225 ein. Die explizite Berücksichtigung der Enzymkinetik von GAPs, die in früheren Modellen26,27,28 vernachlässigt wurde, ist wichtig, um die (teilweise) GAP-Sättigung in Regionen mit hoher Cdc42-Konzentration zu berücksichtigen. Tatsächlich ist diese Enzymsättigung eine allgemeine Eigenschaft der Enzymkinetik. Es wird eine wesentliche Rolle in unseren Erkenntnissen spielen. Wir berücksichtigen auch die effektive Selbstrekrutierung von Cdc42-GDP in der Membran, die durch membrangebundenes Cdc42-GTP erleichtert wird. Diese effektive Rekrutierung ist für den vesikelbasierten Cdc42-Transport entlang von Aktinkabeln verantwortlich11,29,30 und für mutmaßliche Rekrutierungswege, die durch Cdc42-GTP-Downstream-Effektoren wie Cla4 und Gic1/231,32,33 vermittelt werden. Eine detaillierte Beschreibung des in Abb. 1d dargestellten Modells und eine ausführliche biologische Motivation für die zugrunde liegenden Annahmen finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.

Wir fragen zunächst, ob das vorgeschlagene Reaktions-Diffusions-Modell der Cdc42-Polarisationsmaschinerie die spontane Polarisation in Abwesenheit von Bem1 erklären kann, dh ohne GEF-Co-Lokalisierung mit Cdc42. Zu diesem Zweck führen wir eine lineare Stabilitätsanalyse des Modells durch, die die Regime der selbstorganisierten Musterbildung identifiziert. Eine groß angelegte Parameterstudie (siehe Ergänzende Anmerkung 4) zeigt, dass es in Abwesenheit von Bem1 einen Bereich von Proteinzahlen von Cdc42 und GAP gibt, in dem polare Muster möglich sind (Abb. 2b), dh dass ein latenter Polarisationsmechanismus vorliegt . Im Gegensatz zum Bem1-abhängigen gegenseitigen Rekrutierungsmechanismus (Abb. 2a) stellen wir jedoch fest, dass das Wirkungsregime für diesen latenten Mechanismus eingeschränkter ist und ein ausreichend niedriges GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnis erfordert (Abb. 2b). Um die Ergebnisse der linearen Stabilitätsanalyse zu validieren, führten wir numerische Simulationen der vollständigen nichtlinearen, an die Volumenoberfläche gekoppelten Reaktionsdiffusionen durch (siehe Abb. 2c und Videos 1–6; Details in der Ergänzenden Anmerkung 3 beschrieben).

Stabilitätsdiagramme als Funktion der GAP- und Cdc42-Konzentrationen in Gegenwart und Abwesenheit von Bem1, erhalten durch lineare Stabilitätsanalyse (siehe Ergänzende Anmerkung 2) des mathematischen Modells für die Cdc42-Polarisationsmaschinerie (siehe Methoden). Schattierte Bereiche zeigen Bereiche mit lateraler Instabilität an, das heißt, wo eine spontane Polarisation möglich ist. a In WT-Zellen ist das Gerüstprotein Bem1 vorhanden und erleichtert die spontane Polarisierung durch einen gegenseitigen Rekrutierungsmechanismus, der in einem großen Bereich von Cdc42- und GAP-Konzentrationen wirksam ist10,12. Der grüne Punkt markiert die Cdc42- und GAP-Konzentrationen der WT-Zellen. b In Abwesenheit von Bem1 ist die spontane Polarisation in unserem Modell auf einen viel kleineren Parameterraumbereich beschränkt, da der Wirkungsbereich des Bem1-unabhängigen Mechanismus von Natur aus durch ein kritisches Verhältnis der GAP-Konzentration zur Cdc42-Konzentration begrenzt ist. Die Cdc42- und GAP-Konzentrationen von bem1Δ-Zellen und bem1Δ bem3Δ sind durch das rote Kreuz bzw. den blauen Punkt gekennzeichnet. Die experimentelle Beobachtung, dass bem1Δ-Zellen nicht polarisieren, während bem1Δ bem3Δ polarisiert, kann verwendet werden, um einen Bereich für das kritische GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnis abzuleiten. Eine Erhöhung der GEF-Aktivität von Cdc24 erhöht dieses kritische Verhältnis (gestrichelte blaue Linie). c Schnappschüsse aus numerischen Simulationen, die die Konzentration von membrangebundenem Cdc42-GTP im endgültigen stationären Zustand für verschiedene Mutanten- und Kopienanzahlbedingungen zeigen, entsprechend den Videos 1–4. (In Tafel (iii) stellt der Farbbalken Konzentrationen im Bereich von 0–200 µm–2 dar). (Modellparameter wurden durch Probenahme von Parametersätzen erhalten, die mit den experimentellen Ergebnissen verschiedener Mutanten übereinstimmen, wie ausführlich in der Ergänzenden Anmerkung 4 beschrieben; siehe Ergänzende Abbildungen S3 und S4 sowie Ergänzende Tabellen S2 – S4).

Was ist die mechanistische Ursache für die Einschränkung des GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnisses? Um diese Frage zu beantworten, müssen wir verstehen, wie der Cdc42-Polarisationsmechanismus in Abwesenheit von Bem1 funktioniert. Wie oben betont, erfordert die Cdc42-Polarisierung zwei wesentliche Merkmale: den gerichteten Transport von Cdc42 in die Polarzone und die lokale Aktivierung von Cdc42 dort. Das erste Merkmal, der gerichtete Transport, wird im Modell durch die effektive Rekrutierung von Cdc42-GDP an die Membran erklärt, die durch aktives Cdc42 vermittelt wird (Abb. 1d).

Wie wird das zweite Merkmal, die Lokalisierung der Cdc42-Aktivität in der Polarzone, in Abwesenheit von Bem1 umgesetzt? Anstatt die Rate der Cdc42-Aktivierung in der Polarzone direkt zu erhöhen (durch Rekrutierung des GEF Cdc24 durch Bem1), kann eine Lokalisierung der Aktivität auch dadurch erreicht werden, dass die Rate der Cdc42-Deaktivierung in der Polarzone verringert und außerhalb der Polarzone erhöht wird . Wenn die Enzymsättigung die Netto-Deaktivierungsrate begrenzt, führt eine einfache Erhöhung der Cdc42-Dichte im Allgemeinen zu einer Verringerung der Cdc42-Deaktivierungsrate (pro Cdc42-Molekül). Die Enzymsättigung katalytischer Reaktionen tritt auf, wenn die Dissoziation des transienten Enzym-Substrat-Komplexes (hier des GAP-Cdc42-Komplexes) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist. Die Enzyme, die vorübergehend in Enzym-Substrat-Komplexen gebunden sind, stehen dann nicht für die Bindung an weitere Substratmoleküle zur Verfügung. Tatsächlich wurde gezeigt, dass dies bei der GAP-katalysierten Hydrolyse von Cdc42 in Keimhefe der Fall ist25. Darüber hinaus erfordert die Enzymsättigung, dass ein großer Teil der Enzyme in Enzym-Substrat-Komplexen gebunden ist, dh dass die gesamte Enzymdichte im Vergleich zur Substratdichte ausreichend niedrig ist, wie wir in der linearen Stabilitätsanalyse festgestellt haben (Abb. 2b).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die (teilweise) GAP-Sättigung die Cdc42-Aktivität in der Polarzone lokalisiert: Sie verringert die Deaktivierungsrate in der Polarzone, wo die Cdc42-Dichte hoch ist, im Vergleich zum Rest der Membran, wo die Cdc42-Dichte niedrig ist. Diese lokalisierte Cdc42-Aktivität treibt in Verbindung mit dem Transport von Cdc42 in die Polarzone die spontane Zellpolarisation voran. Interessanterweise ist die Enzymsättigung der Cdc42-Hydrolyse einer der sechs theoretisch möglichen Mechanismen zur Musterbildung, die durch eine generische mathematische Analyse von Rückkopplungsschleifen in GTPase-Zyklen angenommen wurden34.

Der Bem1-unabhängige Rettungsmechanismus erfordert ein ausreichend niedriges GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnis, um funktionsfähig zu sein (Abb. 2b). Dies deutet darauf hin, dass bem1Δ-Zellen nicht polarisieren können, weil ihre GAP-Protein-Kopienzahl zu hoch ist. Unser Modell sagt voraus, dass der Verlust von GAPs die Zellpolarisierung retten kann, indem die Gesamtzahl der Proteinkopien in einen Bereich gebracht wird, in dem der Bem1-unabhängige Mechanismus wirksam ist, wie durch den Pfeil in Abb. 2b angezeigt. Dies steht im Einklang mit Evolutionsexperimenten, die zeigen, dass bem1Δ-Zellen durch eine anschließende Funktionsverlustmutation des GAP Bem33 reproduzierbar gerettet werden. Bem3 macht etwa 25 % der gesamten Proteinkopienzahl aller Cdc42-GAPs aus35, was darauf hinweist, dass bem1Δ-Mutanten nahe an der GAP/Cdc42-Verhältnisschwelle des Bem1-unabhängigen Mechanismus liegen. Diese Nähe der Proteinkopienzahlen zum Schwellenwert erklärt, warum ein geringer Anteil (etwa 1 von 105) der Mutanten in der Lage ist, sich zu polarisieren und zu teilen, nachdem BEM1 gelöscht wurde3: Die Proteinkopienzahlen variieren stochastisch von Zelle zu Zelle, so dass ein kleiner Anteil von Zellen liegt im Konzentrationsbereich, in dem der latente Polarisationsmechanismus die spontane Zellpolarisation vorantreibt. (Für die vier Cdc42-GAPs wurde ein Variationskoeffizient von etwa 0,14 für die Variabilität der Kopienzahl von Zelle zu Zelle gemeldet36. Dies liegt in der gleichen Größenordnung wie die obere Schätzung von 25 % für die erforderliche Reduzierung der Kopienzahl des GAP-Proteins um den Bem1-unabhängigen Rettungsmechanismus zu aktivieren, was darauf hindeutet, dass dieser Mechanismus in einem Bruchteil der bem1Δ-Zellen wirksam ist.)

Anstatt durch den Verlust eines GAP könnte das GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnis auch durch eine Erhöhung der Kopienzahl des Cdc42-Proteins gesenkt werden. Eine weitere Option wäre eine Erhöhung der GEF-Aktivität von Cdc24, was den kritischen Schwellenwert im GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnis erhöhen würde (siehe gestrichelte Linie in Abb. 2b). Im Vergleich zu einer Mutation mit Funktionsverlust haben solche Mutationen jedoch eine viel kleinere Mutationszielgröße und sind daher viel seltener. Darüber hinaus könnte man sich fragen, warum gerade Bem3 und nicht eines der anderen GAPs verloren geht, um den bem1Δ-Stamm zu retten. Einige Hinweise zur Beantwortung dieser offenen Frage liefert eine detaillierte theoretische Analyse des Rettungsmechanismus weiter unten im Abschnitt „Funktionelle Submodule der Zellpolarisation“.

Basierend auf der GAP/Cdc42-Verhältnisbeschränkung im Rettungsmechanismus trifft unsere Theorie zwei spezifische Vorhersagen: (i) Eine Erhöhung der Proteinkopienzahl (dh Überexpression) von Cdc42 wird die Zellpolarisierung von bem1Δ-Zellen durch Aufrufen des Bem1-unabhängigen Mechanismus retten. (ii) Die Polarisation von bem1-Δbem3Δ-Zellen bricht zusammen, wenn die Proteinkopienzahl von Cdc42 im Vergleich zum WT-Wert verringert wird (Abb. 2b).

Um diese Modellvorhersagen experimentell zu testen, konstruierten wir zunächst verschiedene Hefestämme mit Cdc42, markiert mit sfGFP, unter einem induzierbaren Galactose-Promotor. Dies ermöglicht es uns, die Kopienzahl des Cdc42-Proteins durch Variation der Galaktosekonzentration im Wachstumsmedium abzustimmen37: ein bem1Δ-Stamm (yWKD069), ein bem1Δ bem3Δ (yWKD070) und ein modifizierter WT-Stamm (yWKD065) (siehe Methoden). Wir haben bestätigt, dass der sfGFP-Tag auf unserem induzierbaren Cdc42 die Fitness nicht wesentlich verändert (siehe Ergänzende Anmerkung 6.2), im Einklang mit der Literatur zur Lebensfähigkeit und Lokalisierung einer anderen fluoreszierenden Cdc42-Sandwich-Fusion38 in angehender Hefe. Als nächsten Schritt inokulierten wir die verschiedenen Stämme mit unterschiedlichen Galaktosekonzentrationen in 96-Well-Platten, die in ein Plattenlesegerät gegeben wurden, um die Zelldichte über die Zeit zu messen und so die Populationswachstumsrate zu bestimmen (siehe Methoden). Für jede Galactose-Konzentration werden die Wachstumsraten auf die von WT-Zellen normalisiert, wobei Cdc42 unter seinem nativen Promotor (yLL3a) bei derselben Galactose-Konzentration wächst. In Abb. 3a sind die normalisierten Wachstumsraten der verschiedenen Mutanten aufgetragen. Wie erwartet wachsen WT-Zellen bei allen Galaktosekonzentrationen. Im Gegensatz dazu wachsen WT-Zellen mit Cdc42 unter dem Galactose-Promotor (yWKD065) in Abwesenheit von Cdc42 (0 % Galactose-Konzentration) nicht, da eine fehlende Polarisation die Zellteilung stark beeinträchtigt und schließlich zum Zelltod und damit zu einer Wachstumsrate von null führt8 . Unsere Daten zeigen, dass der WT-Mechanismus gemäß der Theorie selbst bei sehr geringer Expression von Cdc42 eher unempfindlich gegenüber der Kopienzahl des Cdc42-Proteins ist (Abb. 2a).

a Die relative Wachstumsrate (Fitness) von Mutanten als Funktion der Galaktosekonzentration (Proxy für die Kopienzahl des Cdc42-Proteins) zeigt, dass eine höhere Expression von Cdc42 bem1Δ-Zellen und in geringerem Maße bem1Δ bem3Δ-Zellen rettet. Markierungen geben die Mittelwerte der Posterior-Wahrscheinlichkeitsverteilung für die Fitness an, die Fehlerbalken geben die 68 %-glaubwürdigen Intervalle an (siehe Methoden). Große Fehlerbalken resultieren aus der Variabilität zwischen technischen Replikaten und weil unter bestimmten Bedingungen, z. B. bem1Δ bei 0,03 % Galaktose, das Wachstum sehr selten ist (siehe Ergänzende Anmerkung 6.1). Die Anzahl der Experimente pro Dehnungs-Bedingungs-Paar ist in der Ergänzungstabelle S5 angegeben. Zu den absoluten Wachstumsraten (nicht auf WT normiert) siehe ergänzende Abbildung S6. b Mikroskopische Aufnahmen aller Stämme in 0,06 % Galaktose nach 24-stündiger Inkubation. WT-Hefezellen mit Cdc42 unter der Galaktose bzw. dem nativen Promotor treten in die stationäre Phase ein und werden 1000-fach verdünnt (obere Reihe). Die bem1Δ- und bem1Δ bem3Δ-Zellen befinden sich in der logarithmischen Phase und sind 100-fach verdünnt (untere Reihe).

Unser Modell sagt voraus, dass bem1Δ-Zellen die höchste Kopienzahl des Cdc42-Proteins zur Polarisation benötigen, WT-Zellen die geringste benötigen und die bem1Δ-bem3Δ-Zellen dazwischen liegen sollten. Wir stellen tatsächlich fest, dass der bem1Δ-Stamm (yWKD069) in Medien mit einer Galactosekonzentration von 0,1 % oder mehr wächst. Wir inokulierten diese Stämme bei niedrigeren Galactosekonzentrationen, beobachteten jedoch nie ein Wachstum der Stämme bem1Δ und bem1Δbem3Δ in mehr als einem technischen Replikat (von 6 bzw. 4) pro Bedingung (siehe Ergänzungstabelle S3). Wir führen das seltene Wachstum bei niedrigen Galaktosekonzentrationen auf das Auftreten von Suppressormutationen zurück. Daher konzentrieren wir uns auf den Vergleich der Wachstumsraten. Es gibt starke und positive Beweise dafür, dass bem1Δbem3Δ in der Galaktosekonzentration von 0,06 %, 0,1 % bzw. 0,2 % schneller wächst als bem1Δ (Bayes-Faktoren 7, 131 und 6 und unter Verwendung von Interpretationsqualifikationen aus Lit. 39). Bei WT-Zellen mit Cdc42 unter dem Galactose-Promotor beobachten wir eine verringerte Wachstumsrate bei einer Galactose-Konzentration von 0,01 %, das Wachstum wird jedoch erst bei einer Galactose-Konzentration von 0 % vollständig gehemmt. Alle oben genannten experimentellen Beobachtungen stimmen mit unseren spezifischen theoretischen Vorhersagen überein.

Darüber hinaus untersuchten wir den Einfluss der Kopienzahl des Cdc42-Proteins auf die Zellmorphologie (siehe Abb. 3b) und die Lebensfähigkeit, wie im Ergänzungsmaterial erläutert. Diese Experimente stützen die Schlussfolgerungen unserer Wachstumstests, nämlich dass die Lebensfähigkeit zunimmt und die Größe (als Stellvertreter der Polarisationszeit3,40) mit zunehmender Proteinkopienzahl abnimmt.

Zusammengenommen bestätigen die experimentellen Daten die theoretische Vorhersage, dass der Bem1-unabhängige Rettungsmechanismus nur unterhalb eines Schwellenwerts des GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnisses funktionsfähig ist. Darüber hinaus stellen wir fest, dass der Bem1-abhängige WT-Mechanismus überraschend unempfindlich gegenüber der Kopienzahl des Cdc42-Proteins ist, dh auch bei sehr niedrigen Cdc42-Konzentrationen funktioniert. Im Kontext unserer Theorie wird dieser signifikante Unterschied in der Empfindlichkeit der Cdc42-Proteinkopienzahl durch den qualitativen Unterschied ihrer Funktionsprinzipien erklärt (siehe „Das Cdc42-Interaktionsnetzwerk erleichtert einen latenten Polarisationsmechanismus“). Der WT-Mechanismus basiert auf der Rekrutierung des GEF Cdc24 in die Polarzone, vermittelt durch das Gerüstprotein Bem1. Im Gegensatz dazu beinhaltet der Rettungsmechanismus aufgrund der hohen Cdc42-Dichte in der Polarzone entscheidend die Enzymsättigung der Cdc42-Hydrolyse. Diese Enzymsättigung erfordert eine ausreichend große Kopienzahl des Cdc42-Proteins im Verhältnis zur Kopienzahl des GAP-Proteins. Im folgenden Abschnitt „Funktionelle Submodule der Zellpolarisation“ werden wir das mathematische Modell und die qualitativen und konzeptionellen Unterschiede zwischen diesen beiden Mechanismen genauer analysieren.

In früheren Experimenten wurden mehrere Bem1-Mutanten untersucht, die die Fähigkeit von Bem1 beeinträchtigen, die Co-Lokalisierung von Cdc24 zu Cdc42-GTP zu vermitteln, dem Schlüsselmerkmal, das der Funktionsweise des WT-Mechanismus zugrunde liegt17,20,21,41,42,43. Die Beobachtungen aus diesen Experimenten blieben bisher rätselhaft und offenbar widersprüchlich. Wie wir in der ergänzenden Diskussion in der ergänzenden Anmerkung 5 ausführlich zeigen, erklärt der von unserem mathematischen Modell vorhergesagte latente Rettungsmechanismus alle diese früheren experimentellen Ergebnisse und bringt sie in Einklang. Die wichtigste Erkenntnis ist, dass der latente Rettungsmechanismus durch einen globalen Anstieg der GEF-Aktivität aktiviert werden kann (siehe gestrichelte Linie in Abb. 2b). Bem1-Mutanten, denen die Cdc42-Interaktionsdomäne fehlt, die aber dennoch an den GEF Cdc24 binden, könnten zu einem solchen globalen Anstieg der GEF-Aktivität führen und so die Polarisierung von bem1Δ-Zellen retten. Darüber hinaus sagt unser mathematisches Modell in Übereinstimmung mit optogenetischen Experimenten43 voraus, dass der latente Bem1-unabhängige Mechanismus auch außerhalb des Regimes der spontanen Polarisation durch eine ausreichend starke lokale Störung der membrangebundenen GEF-Konzentration induziert werden kann.

Die Zellpolarisation in Keimhefe ist ein Funktionsmodul, das auf einem komplexen Proteininteraktionsnetzwerk mit Cdc42 als zentralem Polaritätsprotein basiert (vgl. Abb. 1b – d). Wie wir als nächstes besprechen, kann das gesamte Netzwerk in funktionale Submodule zerlegt werden. Hier bezieht sich der Begriff „funktionales Submodul“ auf einen Teil des gesamten Interaktionsnetzwerks mit einer genau definierten Funktion in einem oder mehreren musterbildenden Mechanismen. Unsere theoretische Analyse wird zeigen, dass ein Zusammenspiel von jeweils zwei (oder mehr) funktionellen Submodulen einen voll funktionsfähigen Zellpolarisationsmechanismus darstellt. Wichtig ist, dass die Submodule aus dem Zusammenspiel verschiedener Akteure (Komponenten) im biochemischen Interaktionsnetzwerk und dem räumlichen Transport von Proteinen (durch Diffusion und entlang von Aktinkabeln) entstehen.

Wie wir in der „Einleitung“ dargelegt haben, erfordert die Etablierung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität, dass die Cdc42-Aktivität auf Membranregionen mit einer hohen Cdc42-Dichte lokalisiert ist. Dies kann auf zwei verschiedene Arten erreicht werden. Erstens durch die Rekrutierung des Gerüstproteins Bem1 zu Cdc42-GTP, das wiederum den GEF (Cdc24) rekrutiert und somit die Cdc42-Aktivierung in der Polarzone lokalisiert, wo die Cdc42-Dichte hoch ist (Abb. 4a, oben links). Wir nennen dies das polare Aktivierungssubmodul. Zweitens kann die GAP-Sättigung in Regionen mit hoher lokaler Cdc42-Dichte die Cdc42-Aktivität in der Polarzone lokalisieren (Abb. 4a, oben rechts), wie oben im Unterabschnitt „GAP-Sättigung kann Cdc42 in der Polarzone lokalisieren“ beschrieben. Die vorübergehende (partielle) Sequestrierung von GAPs in Cdc42-GAP-Komplexen ist für dieses polare GAP-Sättigungssubmodul von wesentlicher Bedeutung. Das dritte Submodul (Abb. 4a, unten), das wir als Cdc42-Transport bezeichnen, umfasst verschiedene Arten des Cdc42-Transports in Richtung der Polarzone: Vesikeltransport entlang polarisierter Aktinkabel (vgl. Abb. 1b) und effektive (Selbst-)Rekrutierung von Cdc42 aus das Zytosol. Mehrere Experimente deuten darauf hin, dass nachgeschaltete Effektoren von aktivem Cdc42, wie Cla4, Gic1 und Gic2, in Abwesenheit von Bem131,33,44 eine solch wirksame Rekrutierung ermöglichen könnten.

a Drei funktionelle Submodule des Cdc42-Interaktionsnetzwerks tragen zur Bildung und Aufrechterhaltung einer Polarzone bei (Region mit hoher Cdc42-GTP-Konzentration, rot hervorgehoben): Transport von Cdc42 in Richtung der Polarzone (violetter Kreis). Eine hohe Cdc42-Aktivität kann aufgrund der GAP-Sättigung in der Polarzone (blaugrünes Quadrat) und durch den Transport des GEF zur Polarzone über das Gerüstprotein Bem1 (gelbes Dreieck) aufrechterhalten werden. b Kombinationen von Paaren dieser funktionalen Submodule stellen Mechanismen der selbstorganisierten Musterbildung dar. c–e Diese Mechanismen sind in unterschiedlichen Regimen der gesamten Proteinkopienzahl von Cdc42 und GAPs wirksam. Der WT-Mechanismus (f) ist weitgehend unempfindlich gegenüber Variationen der Proteinkopienzahl (c), da er auf der gegenseitigen Rekrutierung von Cdc42- und Bem1-GEF-Komplexen basiert und nicht von der Sättigung von GAPs in der Polarzone abhängt. Wenn der GEF hingegen nicht in die Polarzone transportiert wird (z. B. aufgrund einer Deletion von Bem1), sorgt nur die GAP-Sättigung in der Polarzone für eine hohe Cdc42-Aktivität, während außerhalb der Polarzone die Deaktivierung dominiert. Daher reagiert der Polarisationsmechanismus (g) empfindlich auf die Kopienzahl des GAP-Proteins (d). h Bemerkenswert ist, dass, wenn der Transport von Cdc42 unterdrückt wird, z. B. durch starke Bindung an die Membran, eine Kombination aus Bem1-GEF-Komplex-Rekrutierung und polarer GAP-Sättigung eine lokalisierte hohe Cdc42-Aktivität aufrechterhält, obwohl die Gesamtdichte von Cdc42 homogen verteilt ist.

Diese drei funktionalen Submodule repräsentieren unterschiedliche mechanistische Aspekte des Cdc42-Interaktionsnetzwerks. Jedes Untermodul ist nur unter bestimmten Einschränkungen der biochemischen Eigenschaften und Proteinkopienzahlen der beteiligten Proteine ​​betriebsbereit. Im Folgenden nutzen wir diese Einschränkungen aus, um die Rollen der Submodule im mathematischen Modell zu untersuchen, indem wir sie einzeln deaktivieren. Dies ermöglicht es uns, die Mechanismen zu entschlüsseln, die unter den entsprechenden experimentellen Bedingungen ablaufen. Das erste Submodul, die Polaraktivierung, wird durch das Ausschalten von Bem1 deaktiviert. Das zweite Submodul, die polare GAP-Sättigung, wird unterdrückt, wenn die Proteinkopienzahl der GAPs zu hoch ist. Alternativ wird die polare GAP-Sättigung außer Betrieb gesetzt, wenn die Dissoziationsrate des GAP-Cdc42-Komplexes zu schnell ist oder wenn die freien GAPs sehr schnell diffundieren, wodurch zusätzliche freie GAPs in der Polarzone leicht verfügbar werden. Das dritte Submodul, der Cdc42-Transport, kann durch die Immobilisierung von Cdc42, also die Unterdrückung seiner räumlichen Umverteilung, abgeschaltet werden. Experimentell wurde dies in Spalthefe durch die Fusion von Cdc42 mit einem Transmembranprotein erreicht, das stark an die Membran bindet und dort nahezu unbeweglich ist41.

Es ist erwähnenswert, dass Bem1 Teil von zwei funktionalen Submodulen ist: Die Rekrutierung von GEF in die Polarzone sorgt für eine polare Aktivierung, die Rekrutierung von Cdc42 trägt zum Cdc42-Transport bei. Während die polare Aktivierung vollständig von Bem1 abhängt, gibt es mehrere Bem1-unabhängige Modi des Cdc42-Transports, einschließlich des Aktin-basierten Vesikelhandels und anderer mutmaßlicher Rekrutierungsmechanismen (vgl. Abb. 1d). Somit ist das Cdc42-Transportsubmodul in bem1Δ-Zellen weiterhin betriebsbereit.

Als nächstes führten wir eine lineare Stabilitätsanalyse für das vollständige mathematische Modell unter jeder dieser Störungen durch und deaktivierten jeweils eines der Submodule (wie ausführlich in der Ergänzenden Anmerkung 4 beschrieben; siehe Ergänzende Tabelle S3). In jedem Fall stellten wir fest, dass die verbleibenden zwei Submodule zusammenwirken und einen Mechanismus für die spontane Cdc42-Polarisation bilden, wie in Abb. 4b dargestellt. Abbildung 4c–e zeigt den Wirkungsbereich der drei verschiedenen Mechanismen als Funktion der gesamten Cdc42- und GAP-Konzentrationen. Abbildung 4f – h veranschaulichen das konzertierte Zusammenspiel von gerichtetem Proteintransport und Regulierung der Cdc42-Aktivität (Aktivierung/Deaktivierung), das der Cdc42-Polarisierung in diesen drei Mechanismen zugrunde liegt.

Bevor wir uns den detaillierten Beschreibungen dieser Mechanismen zuwenden, stellen wir fest, dass das verbleibende Submodul allein die Musterbildung nicht erleichtern kann, wenn zwei Submodule gleichzeitig deaktiviert werden. Insbesondere und vielleicht etwas kontraintuitiv reicht die Selbstrekrutierung von Cdc42 allein nicht aus, um die spontane Zellpolarisation voranzutreiben34,45.

Das Zusammenspiel des Cdc42-Transportsubmoduls und des Cdc42-Bem1-Cdc24-Rekrutierungssubmoduls (polare Aktivierung), dargestellt in Abb. 4f, bildet den WT-Mechanismus, der über die gegenseitige Rekrutierung von Cdc42 und Bem18,11,12 funktioniert. Charakteristisch für diesen Mechanismus ist die gemeinsame Lokalisierung von Cdc24 und Cdc42-GTP in der Polarzone, wie in früheren Experimenten beobachtet42,43. Anders als der Rettungsmechanismus erfordert der gegenseitige Rekrutierungsmechanismus keine polare GAP-Sättigung. Daher ist er gegenüber hohen GAP-Konzentrationen unempfindlich, d. h., er ist bei viel höheren GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnissen einsatzbereit als der Rettungsmechanismus. Darüber hinaus ist es robust gegenüber hoher Diffusivität freier GAPs und hohen Katalyseraten der GAPs (schneller Zerfall von GAP-Cdc42-Komplexen in freies GAP und Cdc42-GDP). Dies impliziert, dass in mathematischen Modellen des WT-Mechanismus die GAPs implizit durch eine konstante und homogene Hydrolyserate erklärt werden können, wie in früheren Modellen 10, 12, 42, 46. Insbesondere vermittelt Bem1 in diesen Modellen sowohl die polare Aktivierung als auch den Cdc42-Transport (über die Rekrutierung aus dem Zytosol).

Der latente, Bem1-unabhängige Rettungsmechanismus funktioniert durch das Zusammenspiel von GAP-Sättigung in der Polarzone (dargestellt in Abb. 4g) und Cdc42-Transport (einschließlich effektiver Selbstrekrutierung über Aktin und/oder andere nachgeschaltete Effektoren wie Cla4). Charakteristisch für diesen Mechanismus ist, dass er keine Co-Lokalisierung von Cdc24 mit Cdc42-GTP in der Polarzone erfordert (siehe Abb. 4g). In zukünftigen Experimenten könnte dieses Fehlen (oder die starke Verringerung) der Cdc24-Polarisierung als klarer Indikator für den Rettungsmechanismus dienen. Wie oben erläutert, beruht der Rettungsmechanismus auf der GAP-Sättigung in der Polarzone, um dort eine hohe Cdc42-Aktivität aufrechtzuerhalten. Wenn die Cdc42-Aktivität durch eine geringere GAP-Aktivität aufrechterhalten wird, erwarten wir im Vergleich zu WT-Zellen längere Verweilzeiten von Cdc42 in der Polarzone. Diese Vorhersage könnte in zukünftigen Experimenten überprüft werden.

Die GAP-Sättigung wird entweder durch hohe Häufigkeit, hohe katalytische Aktivität oder schnellen Transport (durch zytosolische Diffusion oder Vesikelrecycling) der GAPs unterdrückt. Die letzte Einschränkung liefert eine plausible Erklärung, warum speziell Bem3 gelöscht werden muss, um bem1Δ-Zellen zu retten. Im Gegensatz zu Rga1 und Rga2 erwies sich Bem3 als äußerst mobil, wahrscheinlich weil es durch das Zytosol zirkuliert47. Die GAP-Sättigung, also die Verarmung an freien GAPs in der Polarzone, führt zu einem Gradienten der freien GAP-Dichte in Richtung der Polarzone. Eine mobile GAP-Art wie Bem3 diffundiert schnell entlang dieses Gradienten, um die freien GAPs in der Polarzone wieder aufzufüllen. Dieser Zustrom entlastet dort die GAP-Sättigung und wirkt so der Aktivierung von Cdc42 in der beginnenden Polarzone entgegen. Daher fördert der Verlust von Bem3 anstelle eines der anderen, weniger mobilen GAPs die Bildung einer stabilen Polarzone.

Das Zusammenspiel der Cdc42-Bem1-Cdc24-Rekrutierung (polare Aktivierung) und der polaren GAP-Sättigung, dargestellt in Abb. 3H, erleichtert die Polarisierung der Cdc42-Aktivität ohne die räumliche Umverteilung der Gesamtdichte von Cdc42 (blaue Linie in Abb. 3h, oben). Stattdessen werden Bem1 und GEF umverteilt. Die Polarzone ist durch eine hohe Konzentration membrangebundener Bem1-GEF-Komplexe gekennzeichnet, die die Cdc42-Aktivität lokal erhöhen. Cdc42-GTP wiederum rekrutiert weitere Bem1- und GEF-Moleküle in die Polarzone. Charakteristisch für diesen Mechanismus ist, dass Cdc42-GTP polarisiert ist, während die gesamte Cdc42-Dichte auf der Membran gleichmäßig bleibt. Experimentell wurde dies in Spalthefe beobachtet, bei der Cdc42 an eine Transmembrandomäne (Cdc42-psy1TM) fusioniert wurde, die Cdc42 nahezu unbeweglich macht. Die Polarisationsmaschinerie der Spalthefe ist eng mit der der Keimhefe verwandt; Es basiert auf dem gleichen gegenseitigen Rekrutierungsweg, wobei Scd1 und Scd2 die Rollen von Cdc24 und Bem114 übernehmen. In zukünftigen Experimenten wäre es interessant zu testen, ob Cdc42-psy1TM auch die Polarisierung in aufkeimender Hefe erleichtert (möglicherweise in einem Stamm mit veränderter GAP- oder Cdc42-Proteinkopienzahl, da das Betriebsregime möglicherweise nicht mit den WT-Proteinkopienzahlen übereinstimmt).

Wir haben herausgefunden, dass innerhalb des Proteinnetzwerks, das der Zellpolarisierung in aufkeimenden Hefen zugrunde liegt, mehrere redundante Selbstorganisationsmechanismen koexistieren. Dies erklärt die bemerkenswerte Widerstandsfähigkeit dieses Moduls: Es bleibt unter vielen experimentellen (genetischen) Störungen betriebsbereit13,20,21,41,43,48. Während wir feststellen, dass die Cdc42-Polarisationsmaschinerie gegenüber vielen genetischen Störungen robust ist, haben wir uns besonders auf eine ihrer Schlüsselkomponenten, Bem1, konzentriert, da in einem früheren Experiment eine schnelle und reproduzierbare Erholung nach ihrer Deletion festgestellt wurde3. Durch die Zerlegung des gesamten zellulären Polarisationsmoduls in funktionelle Submodule haben wir drei unterschiedliche Mechanismen der selbstorganisierten Musterbildung identifiziert. Neben dem Wildtyp-Mechanismus, der auf der Kolokalisierung von Cdc42 mit seinem GEF über Bem1 beruht, umfasst dies einen latenten und Bem1-unabhängigen Rettungsmechanismus sowie einen Mechanismus, der von der Cdc42-Umverteilung unabhängig ist. Unsere Theorie, die mit veröffentlichten Experimenten kompatibel ist, zeigt, dass diese Mechanismen viele Komponenten und Interaktionswege dieses Netzwerks gemeinsam haben. Dies impliziert, dass die Redundanz der Zellpolarisation nicht auf der Ebene einzelner Komponenten oder Interaktionen liegt, sondern auf der Ebene der entstehenden Funktion selbst entsteht. Wenn ein Submodul nicht mehr funktionsfähig ist, stellt die Kombination der verbleibenden Submodule immer noch einen Betriebsmechanismus der Zellpolarisierung dar – wenn Parameter, insbesondere Proteinkopienzahlen, auf ein Parameterregime abgestimmt sind, bei dem diese verbleibenden Submodule betriebsbereit sind. Redundanz sorgt somit für Anpassungsfähigkeit – die Fähigkeit, die Funktion trotz (genetischer) Störungen aufrechtzuerhalten. Wichtig ist, dass die Submodule entstehend sind: Sie beinhalten das Zusammenspiel mehrerer Netzwerkkomponenten, ihre biochemischen Wechselwirkungen und ihren räumlichen Transport.

Unsere Analyse in Bezug auf funktionale Submodule liefert ein mechanistisches Verständnis der Polarisationsmaschinerie, bei der molekulare Details „grobkörnig“ wurden. Im Kontext von Genotyp-Phänotyp-Karten könnte diese grobkörnige Beschreibung in ein Zellzyklusmodell integriert werden, um Fragen zur Epistase zu beantworten49 und schließlich Evolutionsverläufe in einem Populationsdynamikmodell vorherzusagen.

Interessanterweise beruht die Bildung von Min-Proteinmustern in E. coli auf demselben Mechanismus wie der Rettungsmechanismus für die Cdc42-Polarisierung: Selbstrekrutierung einer ATPase (MinD) und Enzymsättigung des AAP (MinE), das MinDs katalysiert Hydrolyse und anschließende Membrandissoziation50,51,52. Die transienten MinDE-Komplexe spielen hier die analoge Rolle zu den Cdc42-GAP-Komplexen: In Regionen mit hoher MinD-Dichte wird MinE in MinDE-Komplexen sequestriert, was die Hydrolysegeschwindigkeit begrenzt, bis die Komplexe dissoziieren oder zusätzliches MinE durch Diffusion eindringt. Da MinE durch das Zytosol zirkuliert, diffundiert es schnell in die Polarzone, wo die Dichte an freiem MinE gering ist. Dieser diffusive Zustrom verringert die Enzymsättigung in der Polarzone und führt schließlich zu einer Umkehr der MinD-Polaritätsrichtung. Der wiederholte Wechsel der MinD-Polarität aufgrund der Umverteilung von MinE führt zu den Min-Oszillationen in E. coli. Kürzlich wurden in vitro auch stationäre Min-Muster beobachtet53. Umgekehrt findet man oszillierende Cdc42-Dynamik in der Spalthefe S. Pombe32 und wurde indirekt auch in aufkeimenden Hefemutanten46,54 beobachtet.

Die grundlegende Frage der evolutionären Zellbiologie lautet: „Wie funktionieren Zellen und wie sind sie zu dem geworden, was sie sind?“55. Unsere eingehende Analyse der Hefepolarisationsmaschinerie gibt eine Antwort auf die erste Hälfte dieser Frage für ein bestimmtes biologisches System. Es ermöglicht uns auch, uns der zweiten Hälfte zu nähern und eine konkrete Hypothese zu entwickeln, wie sich die Cdc42-Zellpolarisationsmaschinerie der aufkeimenden Hefe aus einer rudimentäreren Vorfahrenform entwickelt haben könnte.

Unsere theoretischen und experimentellen Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Proteinkopienzahlen als Kontrollparameter, die bestimmen, ob ein Mechanismus der spontanen Zellpolarisation wirksam ist. Aus genetischer Sicht sind die Gene, die für Komponenten der Zellpolarisationsmaschinerie kodieren, dosisempfindlich56. Dies bedeutet einerseits, dass Mutationen von cis-regulatorischen Elementen (wie Promotoren und Enhancern)57 die Proteinkopienzahlen von Proteinen an den Betriebsmodus eines bestimmten Zellpolarisationsmechanismus anpassen und die Funktion innerhalb dieses Modus optimieren können. Andererseits schränkt die Empfindlichkeit der Proteinkopienzahl die Entwicklung der Komponenten der Polarisationsmaschinerie durch Duplikation und Subfunktionalisierung ein56,58.

Eine unserer wichtigsten Erkenntnisse ist, dass die Einschränkungen eines einzelnen bestimmten Mechanismus durch die Koexistenz mehrerer redundanter Mechanismen der Selbstorganisation, die innerhalb desselben Protein-Interaktionsnetzwerks funktionieren, umgangen werden können. Die Wirkmechanismen – und damit auch die Dosierungsempfindlichkeit bestimmter Gene – können sich zwischen diesen unterschiedlichen Mechanismen stark unterscheiden. Daher ermöglicht die Redundanz auf der Ebene der Mechanismen den Komponenten des Moduls, Einschränkungen wie die Empfindlichkeit der Proteinkopienzahl zu überwinden, und fördert so die „Evolvierbarkeit“ – das Potenzial von Komponenten, neue (Unter-)Funktionen zu erwerben und gleichzeitig die ursprüngliche Funktion des Moduls beizubehalten. Frühere Arbeiten haben gezeigt, wie zusätzliche negative Rückkopplungsschleifen auch den Betriebsmodus des WT-Mechanismus verbessern können28.

Ein besonderes Beispiel im Zellpolarisationsmodul der Keimhefe, bei dem eine Duplikation und Subfunktionalisierung stattgefunden haben könnte, ist die Diversifizierung der verschiedenen GAPs von Cdc42 in der Keimhefe. Bem3, Rga1 und Rga2 spielen individuelle Rollen bei bestimmten zellulären Funktionen, wie dem Pheromon-Reaktionsweg47,59, der axialen Knospung60 und dem Zeitpunkt der Polarisation61; siehe62 für eine Visualisierung. Der Ursprung dieser GAP-Vielfalt liegt in ihrer Förderung durch Zellpolarisationsmechanismen, die unempfindlich gegenüber der Kopienzahl des GAP-Proteins sind, wie beispielsweise der Bem1-vermittelte WT-Mechanismus. Wie wir weiter unten darlegen werden, liefert diese Vorstellung eine konkrete Hypothese über die Rolle von Gerüstproteinen wie Bem1 für die Entwicklung von Funktionsmodulen, die durch das Zusammenspiel vieler interagierender Komponenten funktionieren.

Im Zusammenhang mit zellulären Signalprozessen wurde zuvor vermutet, dass die Evolution Gerüstproteine ​​nutzen könnte, um neue Funktionen für angestammte Proteine ​​zu entwickeln, indem sie die Selektivität in Signalwegen reguliert, das Ausgabeverhalten formt und neue Reaktionen aus bereits vorhandenen Signalkomponenten erzielt63. Unsere Untersuchung der Cdc42-Polarisationsmaschinerie gibt einen Einblick, wie Gerüstproteine ​​auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der intrazellulären Selbstorganisation spielen könnten. Das Gerüstprotein Bem1 erzeugt – durch die Verbindung von Cdc42-GTP mit dem GEF von Cdc42 – ein funktionelles Submodul, das zur selbstorganisierten Cdc42-Polarisierung beiträgt. Auf dieser Grundlage schlagen wir eine hypothetische Evolutionsgeschichte für Bem1 vor, die in Abb. 5 dargestellt ist: Der latente Rettungsmechanismus ist generisch und rudimentär und könnte daher ein ursprünglicher Mechanismus der Cdc42-Polarisierung in Pilzen sein. Auf dieser Grundlage könnte sich Bem1 dann schrittweise entwickelt haben: Eine hypothetische Bindung des Bem1-Vorläufers an Cdc24, aber nicht an Cdc42-GTP hätte möglicherweise eine global erhöhte katalytische Aktivität von Cdc24 durch Aufhebung seiner Autohemmung ermöglicht22,23. Unsere Theorie zeigt, dass ein solcher Anstieg der GEF-Aktivität den Bereich der GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnisse erweitert, für die der latente Rettungsmechanismus wirksam ist. Dies hätte einen evolutionären Vorteil mit sich gebracht, da die Robustheit des (hypothetischen) angestammten Mechanismus gegenüber Schwankungen der Proteinkopienzahl erhöht worden wäre. In einem nachfolgenden Schritt könnte der Bem1-Vorläufer dann durch Domänenfusion die Cdc42-Bindungsdomäne (SH3-Domäne) erhalten haben64 und so das vollständige Gerüstprotein bilden, das Cdc24 mit Cdc42-GTP verbindet, das den WT-Polarisationsmechanismus (gegenseitige Rekrutierung von Cdc24 und Cdc24) vermittelt Cdc42). Entlang dieser hypothetischen Evolutionskurve würden die Beschränkungen des GAP/Cdc42-Proteinkopienzahlverhältnisses und der molekularen Eigenschaften der GAPs (kinetische Raten, Membranaffinitäten) gelockert, wodurch die Duplikation und Subfunktionalisierung der GAPs ermöglicht würde58. Angesichts der Tatsache, dass Bem1 in Pilzen hoch konserviert ist2 und dass die Polarisierung der Spalthefe auf demselben gegenseitigen Rekrutierungsmechanismus basiert65,66, könnte dieser hypothetische Evolutionsweg weit in der Vergangenheit liegen.

(Links) Der Bem1-unabhängige „Rettungsmechanismus“, der auf der GAP-Sättigung und dem Cdc42-Transport zum membrangebundenen Cdc42-GTP basiert, funktioniert nur in einem begrenzten Bereich der GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnisse (vgl. Abb. 4d). (Mitte) ein Bem1-Vorläufer (Bem1-Fragment), der an Cdc24 bindet und dessen Autohemmung aufhebt, vergrößert den Bereich lebensfähiger GAP/Cdc42-Konzentrationsverhältnisse und erhöht somit die Robustheit gegenüber Variationen der Proteinkopienzahl (vgl. Abb. 2). Der zugrunde liegende Mechanismus wird dadurch jedoch qualitativ nicht verändert. (Rechts) Die Domänenfusion einer Cdc42-GTP-bindenden Domäne mit dem Cdc24-bindenden Bem1-Vorläufer führt zu einer neuen Verbindung im Cdc42-Interaktionsnetzwerk, die zur Rekrutierung von Cdc24 in die Polarzone führt. Auf der Ebene der Submodule stellt diese neue Verbindung ein neues funktionales Submodul dar, das wir „polare Aktivierung“ (gelbes Dreieck) genannt haben. In Verbindung mit dem Transport von Cdc42 in Richtung der Polarzone führt die polare Aktivierung zu dem äußerst robusten gegenseitigen Rekrutierungsmechanismus, der in WT-Hefe wirksam ist (Betriebsmodus, grün schattiert in der (ND, NG)-Parameterebene; vgl. Abb . 4c). Beachten Sie, dass der Maßstab auf der vertikalen Achse größer gewählt ist, um den deutlich größeren Wirkungsbereich des Bem1-vermittelten Mechanismus hervorzuheben.

Es gibt mehrere mögliche Wege, unsere Hypothesen zu testen. Eine Möglichkeit ist die Konstruktion phylogenetischer Bäume für die verschiedenen Proteine ​​(Domänen), die Aufschluss über die Reihenfolge geben könnten, in der sie während der Entwicklung des Polaritätsnetzwerks auftraten67. Eine andere Möglichkeit besteht darin, im aktuellen Lebensbaum nach Arten zu suchen, die Zwischenschritte der Evolutionsbahn enthalten. Beispielsweise Arten mit einer älteren Version von Bem1, denen die SH3-Domäne fehlt, und die Proteinselbstorganisationsprinzipien identifizieren, die der Polarisierung in diesen Arten zugrunde liegen. Angesichts der sehr großen (und immer noch wachsenden) Anzahl sequenzierter Pilzarten2 und des wachsenden Interesses von Zell- und Molekularbiologen an der Arbeit mit Nicht-Modellsystemen68 wird dies zu einer immer realistischeren Option.

Aus einer breiteren Perspektive haben wir gezeigt, wie das Verständnis der mechanistischen Prinzipien, die der Selbstorganisation zugrunde liegen, Einblicke in die Entwicklung zellulärer Funktionen geben kann, ein zentrales Thema in der evolutionären Zellbiologie. Konkret haben wir ein konkretes Beispiel vorgestellt, das zeigt, wie sich ein selbstorganisierendes System durch nur inkrementelle Änderungen von einem eher rudimentären, generischen Mechanismus, der parameterempfindlich ist, zu einem spezifischen, robusten und streng kontrollierten Mechanismus entwickelt haben könnte69.

Das Hauptziel des von uns vorgeschlagenen mathematischen Modells besteht darin, die Rettung von bem1Δ-Zellen durch den Verlust von BEM3 zu erklären. Zu diesem Zweck nehmen wir minimale, aber wesentliche Erweiterungen eines zuvor etablierten Modells vor,12 das den zentralen Cdc42-Polarisationsmechanismus erklärt, der auf dem Bem1-vermittelten Signalweg basiert8,14,18,41,43. Wichtig ist, dass das erweiterte Modell, das wir hier vorschlagen, es uns ermöglicht, mehrere frühere experimentelle Ergebnisse zu erklären, die bisher rätselhaft blieben. Wir werden diese Ergebnisse, die als zusätzliche Unterstützung für unser Modell dienen, in der ergänzenden Diskussion (Ergänzende Anmerkung 5) zusammenfassen und diskutieren. Im Folgenden beschreiben wir die biophysikalischen und biochemischen Prozesse (Diffusion, vesikelbasierter Transport und Proteininteraktionen), die in unserem Modell berücksichtigt werden. Die mathematische Formulierung des Modells im Rahmen oberflächengekoppelter Reaktions-Diffusions-Systeme wird im folgenden Abschnitt vorgestellt. Lineare Stabilitätsanalyse, Parameterprobenahme und numerische Simulationen werden in den Ergänzenden Anmerkungen 2–4 beschrieben.

Die Zelle wird als kugelförmige Domäne mit einer diffusiven Masse (Cytosol) im Inneren und der Membran auf der Oberfläche modelliert, wo Proteine ​​interagieren und seitlich diffundieren (siehe ergänzende Abbildung 1). Volumen- und Oberflächendynamik sind aufgrund der Anlagerung und Ablösung von Proteinen an die Membran gekoppelt. Mathematisch ist das Modell als Reaktions-Diffusionssystem mit Volumen-Oberflächen-Kopplung formuliert. Wie wir im Folgenden darlegen werden, können beide Transportwege – der zytosolische Kreislauf und der vesikelbasierte Transport (Abb. 1b, c im Haupttext) – in diesen Modellierungsrahmen einbezogen werden.

In früheren Arbeiten wurde der Vesikeltransport entlang von Aktinkabeln mit unterschiedlichem Detaillierungsgrad und basierend auf unterschiedlichen Annahmen modelliert9,11,29,30,70,71,72. Allerdings ist eine mechanistisch detaillierte Modellierung des Vesikeltransports derzeit nicht möglich, da der hochkomplexe Vesikelrecyclingweg – bestehend aus Endozytose, Transport entlang Aktinkabeln, Verarbeitung in intrazellulären Membrankompartimenten wie Endosomen und dem Golgi-Apparat und schließlich Exozytose – nicht vollständig möglich ist experimentell charakterisiert. Wie wir sehen werden, ist eine detaillierte Beschreibung für die Analyse hier jedoch nicht erforderlich. Stattdessen modellieren wir das Vesikelrecycling von Cdc42 als effektive Membranrekrutierung von Cdc42-GDP durch Cdc42-GTP. Diese wirkungsvolle Beschreibung umfasst die beiden wesentlichen Merkmale des Vesikelrecyclings, die für die Polarisationsmaschinerie relevant sind: (i) Der Vesikeltransport ist auf membrangebundenes Cdc42-GTP gerichtet und (ii) Cdc42, das von Vesikeln bei Exozytose an die Membran abgegeben wird, ist (meistens) BIP-gebunden71. Einzelheiten werden in der Ergänzenden Anmerkung 1 erläutert.

Zusätzlich zum Vesikel-Recycling wurden mehrere nachgeschaltete Effektoren von Cdc42-GTP – Cla4, Gic1/Gic2 und Flippase31,32,48,73,74 – vorgeschlagen, um die Membranrekrutierung von Cdc42-GDP zu erleichtern (Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 1). ). Wir integrieren diese mutmaßlichen Cdc42-GDP-Rekrutierungswege zusammen mit dem vesikelbasierten Cdc42-Transport durch einen einzigen, effektiven Rekrutierungsprozess, der durch membrangebundenes Cdc42-GTP gesteuert wird (dargestellt in Abb. 1d (4) im Haupttext).

Abbildung 1D zeigt das unserem Modell zugrunde liegende biochemische Interaktionsnetzwerk. Im Mittelpunkt steht der GTPase-Zyklus von Cdc42 ((1) in Abb. 1d). Cdc42 wechselt zwischen einem aktiven, GTP-gebundenen und einem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand auf der Membran. In seiner GDP-gebundenen Form kann Cdc42 an den Guanin-Nukleotid-Dissoziationsinhibitor (GDI) Rdi1 binden, der den Membranbindungsanker von Cdc42 bindet und ihm so eine freie Diffusion im Zytosol ermöglicht. Der Zyklus von Cdc42 zwischen seinen GTP- und GDP-gebundenen Zuständen wird durch den Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) Cdc24 und GTPase-aktivierende Proteine ​​(GAPs) reguliert, die die Hydrolyse von GDP zu GTP katalysieren. In Wildtyp-Zellen rekrutiert Cdc42-GTP das Gerüstprotein Bem1 zur Membran, das wiederum das GEF Cdc24 ((2) in Abb. 1d) rekrutiert, um einen Bem1-GEF-Komplex zu bilden. Diese membrangebundenen Bem1-GEF-Komplexe rekrutieren Cdc42-GDP vom Zytosol zur Membran und aktivieren es dort ((3) in Abb. 1d), wodurch die Rückkopplungsschleife (gegenseitige Rekrutierung) geschlossen wird, die der WT-Polarität zugrunde liegt 8, 10, 15; siehe Refs. 14 und 52 für aktuelle Übersichten aus experimenteller bzw. theoretischer Sicht. Diese Rückkopplungsschleife wird durch das in Lit. eingeführte Modell erfasst. 12. Wir nehmen folgende Schlüsselerweiterungen vor:

Explizite Modellierung der Hydrolyse von Cdc42 durch GAPs als katalytische Reaktion mit einem intermediären Cdc42-GAP-Komplex25.

Effektive Membranrekrutierung durch membrangebundenes Cdc42-GTP, die für den vesikelbasierten Transport von Cdc42 zu Zonen mit hoher Cdc42-GTP-Konzentration verantwortlich ist, sowie für weitere mutmaßliche Rekrutierungswege, die durch nachgeschaltete Effektoren von Cdc42-GTP vermittelt werden21,31,32,33.

Membranbindung des GEF Cdc24 unabhängig von Bem1 über die PH-Domäne von Cdc2475.

Die Modellanalyse hinsichtlich funktioneller Untereinheiten zeigt, dass alle drei Erweiterungen erforderlich sind, um die Rettung von bem1Δ-Mutanten im Modell zu beschreiben. Weitere Einzelheiten zu diesen Modellerweiterungen, der biologischen Motivation und den zugrunde liegenden Annahmen werden in der Ergänzenden Anmerkung 1 erläutert.

Da aufkeimende Hefezellen (nahezu) kugelförmig sind, untersuchen wir die Reaktions- und Diffusionsdynamik der Proteine ​​in einer kugelförmigen Geometrie, die aus einem Zytosol (Masse) mit dem Radius R und einer Membran auf der Oberfläche besteht (ergänzende Abbildung S1). Natürlich wählen wir sphärische Koordinaten \(\left(r,\varphi,\theta \right)\). Für eine allgemeine, kompakte Schreibweise bezeichnen wir Konzentrationen membrangebundener und zytosolischer Komponenten durch die Vektoren \(m\) bzw. \(c\).

Im Großen und Ganzen betrachten wir rein diffusive Dynamiken,

mit der Matrix der Diffusionskonstanten \({D}_{c}={{{\mathrm{diag}}}}\left(\{{D}_{i}\}\right)\). Sofern nicht anders angegeben, werden die zytosolischen Diffusionskonstanten alle auf den gleichen Wert \({D}_{c}\) gesetzt, sodass \({D}_{c}={D}_{c}\).

In sphärischen Koordinaten lautet der Laplace-Operator \({\nabla }^{2}\), der auf eine Funktion \(\psi\) wirkt

wobei der „eckige“ Laplace-Operator auf der Kugeloberfläche \(S\) gegeben ist durch

Die Bindung der Masse an die Membran erfolgt durch Anlagerungs-Ablösungs-Reaktionen, die zu Massenflüssen (f) senkrecht zur Oberfläche führen

Dabei ist \(n\) der nach innen gerichtete Normalenvektor der Oberfläche. In sphärischen Koordinaten ist der radiale Gradient durch die radiale Ableitung \(n\cdot \nabla=-{\partial }_{r}\) gegeben. Die Bindungs-Ablösungs-Flüsse \(f\) unseres spezifischen Modells werden weiter unten spezifiziert.

Die Dynamik membrangebundener Komponenten ist gegeben durch

wobei die nichtlineare Funktion \(g\) die nichtlinearen Reaktionen auf der Membran kodiert. Beachten Sie, dass der Diffusionsoperator auf der Membran \({\nabla }_{m}^{2}={{\nabla }_{S}^{2}|}_{r=R}\) mit der Masse übereinstimmt Laplace-Funktion \({\nabla }^{2}\), beschränkt auf die Membran bei \(r=R\). Dies liegt daran, dass die Kugel die Rotationssymmetrien des Diffusionsoperators erfüllt.

Als Abkürzungen für die Proteinkonzentrationen verwenden wir die gleiche Abkürzung wie in Abb. 1 im Artikel: D – Cdc42-GDP; T – Cdc42-GTP; G – Lücken; B – Bem1; F – GEF. (Beachten Sie, dass wir Cdc24 als GEF bezeichnen, um Verwechslungen mit Cdc42 vorzubeugen.) Wir bezeichnen Konzentrationen membrangebundener Spezies mit dem Symbol \(m\) mit Unterindizes in Kleinbuchstaben und zytosolische Konzentrationen mit dem Symbol \(c\) mit Unterindizes in Großbuchstaben (siehe Tabelle 1). Unter Verwendung der oben eingeführten Vektornotation gilt \(c=\left({c}_{D},{c}_{B},{c}_{F}\right),m=\left({m }_{d},{m}_{t},{m}_{{tg}},{m}_{g},{m}_{b},{m}_{{bf}}, {m}_{f}\right)\).

Die im Abschnitt „Ergebnisse“ beschriebenen und in Abb. 1 dargestellten Proteinwechselwirkungen werden durch die Kinetik des Massenwirkungsgesetzes modelliert, wobei die Reaktionsgeschwindigkeiten in der Ergänzungstabelle S1 beschrieben sind. Die Reaktionskinetik lautet

Und

Eine ausführlichere Diskussion der Annahmen und Motivation für die spezifischen Begriffe finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1. Die obige Reaktions-Diffusions-Dynamik bewahrt die Gesamtzahl der Cdc42-, GAPs-, Bem1- und GEF-Moleküle.

Daher sind diese Proteinkopienzahlen Kontrollparameter des Modells.

Wir haben die obigen Reaktions-Diffusions-Gleichungen mithilfe einer linearen Stabilitätsanalyse und numerischen Simulationen analysiert. Einzelheiten finden Sie in den Ergänzenden Erläuterungen 2–4. Kurz gesagt, die lineare Stabilitätsanalyse liefert die Wachstumsraten von Störungen des homogenen stationären Zustands. Aus der resultierenden Dispersionsbeziehung (dargestellt in der ergänzenden Abbildung S2) kann man ablesen, ob eine symmetriebrechende Instabilität vorliegt und welcher Eigenmodus (sphärischer harmonischer Modus im Fall einer sphärischen Zelle) am schnellsten wächst. Experimentelle Schätzungen liegen nur für einige der Parameter vor (siehe Ergänzungstabelle S2). Wir verwenden daher eine lineare Stabilitätsanalyse (die schnell auf einem Computer durchgeführt werden kann), um eine große Anzahl von Parametersätzen (5 × 106) zu untersuchen und diejenigen zu identifizieren, die mit experimentellen Beobachtungen kompatibel sind (zusammengefasst in der Ergänzungstabelle S3). Die resultierenden Parametersätze umfassen mehrere Größenordnungen auf jeder Parameterachse (siehe ergänzende Abbildung S3 und ergänzende Abbildung S4), was darauf hinweist, dass das Modell schlampig ist76,77. Aus diesen Parametersätzen wählen wir einen repräsentativen aus (denjenigen, der dem Mittelwert der Protokollparameter am nächsten kommt, siehe Ergänzungstabelle S4), um die in den Abbildungen gezeigten Stabilitätsdiagramme zu erstellen. 2, 4 und 5. Um die spontane Polarisation aus einem leicht gestörten homogenen stationären Zustand sowie die durch einen lokalen Reiz induzierte Polarisation zu veranschaulichen, haben wir numerische Simulationen mit COMSOL Multiphysics 5.4 durchgeführt (siehe Zusatzfilme 1–6).

Alle verwendeten Medien haben die gleiche Basis mit 0,69 % w/v Hefestickstoffbasis (Sigma) + 0,32 % Aminosäuremischung (4× CSM) (Formedium) + 2 % Raffinose (Sigma). Wir verwendeten unterschiedliche Galactosekonzentrationen, die als x-Gal bezeichnet werden, wobei x den Galactose-Prozentsatz (Gew./Vol.) in den Medien angibt.

Eine Übersicht über alle in dieser Arbeit verwendeten Hefestämme finden Sie in Tabelle 2. Die haploiden Stämme yWKD065, yWKD069, YWKD070, yWKD071 und yWKD073 entstanden alle aus der Sporulation der Diploiden yWKD054 und YWKD055, wobei die erhöhte Histidin-Auxotrophie für Haploide vom Typ a genutzt wurde. Die Diploide yWKD054 und yWKD055 wurden durch Integration der Plasmide pWKD010 bzw. pWKD011 in yLL1123 erzeugt. Die Plasmide pWKD010 und pWKD011 bestehen aus einem pRL368-Rückgrat78 mit einem URA3-selektionierbaren Marker. Nach der Amplifikation dieses Rückgrats ohne GFP wurden Homologieregionen stromaufwärts und stromabwärts von endogenem CDC42 mit Gibson-Assemblierung hinzugefügt, getrennt durch eine EcoRI-Schnittstelle. Nach dem Schneiden dieser Plasmide mit EcoRI (New England Biolabs) stellten die Homologieflanken die genomische Integration während der Transformation sicher und ersetzten Cdc42 an seinem endogenen Locus. Zusätzlich wurde ein Superfolder-GFP (sfGFP,79, Aminosäuresequenz GenBank: QLY89013.1) in pWKD011 mit Gibson-Anordnung zwischen den Positionen L134 und R135 von CDC42 hinzugefügt. Dies basiert auf früheren Arbeiten zu S. cerevisiae, bei denen ein mCherry in Cdc4213 integriert wurde. Wir haben die Fitnesseffekte von mcherry-Cdc42SW durch die Verwendung eines Superfolder-GFP-Proteins eliminiert, wie in der Arbeit in S. pombe nahegelegt (Bendezú et al., 2015). Plasmide und genomische Integrationen wurden durch Sequenzierung verifiziert.

Die in Abb. 3 dargestellten Tests erforderten kein sfGFP, da geplante Lokalisierungsexperimente mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie unter einem unvollständigen sfGFP-Abbau litten, wie zuvor in der Literatur dokumentiert80. Wir haben getestet, ob die präsentierten Ergebnisse, wie z. B. die Wachstumsratenunterschiede zwischen den Galaktosespiegeln, nicht ein Artefakt der Zugabe dieses Fluorophors oder Auxotrophieunterschiede zwischen den Stämmen sind. Wir haben bestätigt, dass das Vorhandensein der sfGFP-Insertion die Wachstumsrate von Zellen mit CDC42 unter dem Gal-Promotor unter verschiedenen Galaktosebedingungen nicht signifikant beeinflusst (siehe ergänzende Abbildung S5 und ergänzende Tabellen S6 und S7). Darüber hinaus wurde das Medium mit der vierfachen normalen Aminosäurekonzentration ergänzt, um Unterschiede in den Auxotrophien zwischen yLL3a und den anderen Stämmen auszugleichen. In Abb. 3 wurde kein Unterschied in den maximalen Wachstumsraten von YWKD065a und yLL3a beobachtet.

Wir verwendeten einen Plattenleser (Infinite M-200 pro, Tecan) für Wachstumsratentests mit 96-Well-Platten von Thermo Scientific, Nunc Edge 2 96 F CL, unbehandeltem SI-Deckel, KAT.-NR.: 267427. Reihen A und H und Die Spalten 1 und 12 wurden nicht für Messungen verwendet. Wir inokulierten eine 96-Well-Platte mit 100 μl Medium und 5 μl Zellen (aus Glycerin-Vorräten) in jeder Vertiefung und ließen die Zellen in einer 96-Well-Platte 48 Stunden lang bei 30 °C in einem warmen Raum wachsen. Anschließend wurden die Zellen 200-fach in einer neuen 96-Well-Platte verdünnt, diese dann in den Plattenleser gegeben und die OD600 48 Stunden lang unter Verwendung einer Kombination aus linearem und orbitalem Schütteln bei 36 °C gemessen. Wir haben ein selbst geschriebenes Datenanalyseprogramm in Matlab81 verwendet, um die logarithmische Phasenverdopplungszeit für jede Vertiefung zu bestimmen. Die Verdopplungszeit wurde durch Anpassen der Steigung des linearen Regimes des logarithmischen Diagramms der Rohdaten angenähert. Wir haben mindestens zwei verschiedene Experimente pro Bedingung durchgeführt und wir haben mindestens 4 technische Wiederholungen pro Stamm-Bedingungs-Kombination durchgeführt (außer bei 2 % Galactose); siehe Ergänzungstabelle S5.

Die Posterioren von Nicht-WT-Hintergründen folgten aus der Normalisierung auf WT-Raten durch Monte-Carlo-Simulationen des Quotienten der ursprünglichen, nicht normalisierten Wachstumsraten-Posteriori in einem genetischen Hintergrund und der WT-Posteriori in diesem Medium. Die nicht normalisierten Posterioren wurden unter Verwendung des Metropolis-Hastings-Algorithmus82 aus einem rechteckigen Prior und Student-t-Likelihood-Funktionen der Verdopplungszeit-Fit-Schätzungen aller Replikate in diesem Medium berechnet. Die Standardfehler einzelner Schätzungen ergeben sich aus dem Standardfehler des Steigungsparameters, der sich aus der gewichteten kleinsten Quadrate (WLS) in einem gleitenden Fenster pro OD-Kurve ergibt, wobei ein Instrumentenfehler-Proxy für die WLS-Gewichte verwendet wird. Die Standardfehler der einzelnen Schätzungen werden hinsichtlich Überdispersion durch das durchschnittliche modifizierte Birge-Verhältnis83 über alle Medien für WT korrigiert.

Die Mikroskopiebilder wurden mit einem inversen Nikon Eclipse Ti-E-Mikroskop mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv, einer NA von 1,40 und einem Zoomfaktor von 1,5 aufgenommen. Wir verwendeten 96 schwarze Multiwellplatten, die dem SBS-Standardformat (Society for Biomolecular Screening) entsprechen, mit Deckglasböden aus Borosilikatglas.

Die Zellen wurden unter Verwendung des ersten Teils des Wachstumsraten-Assay-Protokolls (im Plattenlesegerät bei 30 °C für 48 Stunden) inkubiert. Dann wurden sie 100-fach verdünnt auf eine neue Platte gegeben und 24 Stunden lang bei 36 °C inkubiert, bevor sie eine vollständige Sättigung erreichten. Die Zellen wurden 1000-fach für die WT-Hintergründe für alle Galaktosekonzentrationen und 100-fach für Nicht-WT-Hintergründe für Galaktosekonzentrationen über 0,05 % verdünnt.

Das zur Inkubation und Verdünnung der Zellen verwendete Medium war 4xCSM +2 % Raffinose mit den jeweiligen Galactosekonzentrationen für jeden Stamm.

Alle Mikroskopiebilder wurden mit einem inversen Mikroskop Olympus IX81 aufgenommen, das mit den Modulen Andor Revolution und Yokogawa CSU X1 ausgestattet war. Wir haben ein 100-fach Ölobjektiv verwendet. Die installierte Erfassungssoftware ist Andor iQ3. Die CG-Speicherfolien stammten von Zell-Kontakt. Es handelt sich um schwarze Multiwellplatten, die dem SBS-Standardformat (Society for Biomolecular Screening) entsprechen und über Deckglasböden aus Borosilikatglas verfügen.

Die Zellen wurden in einer Übernachtkultur in CSM+ 2 % Raffinose + 2 % Galactose-Medium gezüchtet, ohne eine Sättigung zu erreichen. Am nächsten Tag wurden drei Waschschritte mit CSM+ 2 % Raffinose durchgeführt und anschließend wurden die Zellen in den gewünschten Medien von 0 %, 0,06 % und 0,1 % Galactose resuspendiert. Um Zellpopulationen bei allen Galaktosekonzentrationen zu erhalten, haben wir zunächst alle Stämme in einer Galaktosekonzentration von 2 % inkubiert, wobei Cdc42 stark überexprimiert ist, sodass auch bem1Δ-Zellen effizient polarisieren können. Nach 15-stündiger Inkubation in einer Galactosekonzentration von 2 % tauschten wir das Medium auf die gewünschte Galactosekonzentration aus. Nach 24 Stunden beobachteten wir die Zellen lichtmikroskopisch. Nach 24 Stunden ist Cdc42 aus der anfänglichen Inkubation mit einer Galaktosekonzentration von 2 % übriggeblieben (aufgrund von Abbau und Verdünnung sehr niedrig (die Halbwertszeit von Cdc42 beträgt etwa 8 Stunden). Aus diesen Bildern haben wir den durchschnittlichen Zellradius der Zellen in der Population bestimmt.

Beachten Sie, dass sie alle das gleiche Basismedium enthalten: CSM+ 2 % Raffinose. Anschließend wurden die Zellen 8 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, gefolgt von einer Bildgebungssitzung, und anschließend weitere 16 Stunden lang inkubiert, wonach eine weitere Bildgebungssitzung durchgeführt wurde. Wir haben für jede Galaktosekonzentration drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Wir führten Hellfeldmikroskopie-Assays durch, um die Zellgröße über verschiedene Cdc42-Spiegel in unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu überwachen. Mit ImageJ haben wir den Umfang der einzelnen Zellen manuell bestimmt, indem wir die lebenden Zellen mit dem Messwerkzeug an einen Kreis angepasst haben. Wir führten drei unabhängige Experimente pro Bedingung und pro Stamm durch. Darüber hinaus haben wir anhand ihrer Morphologie visuell überprüft, wie viele der Zellen lebten und wie viele tot waren. Wir beobachten einen sogenannten versehentlichen Zelltod85, wenn eine sehr niedrige Kopienzahl des Cdc42-Proteins induziert wird, die durch den Gal-Promotor reguliert wird. Diese Art von Zelltod zeigt einen sehr charakteristischen Phänotyp im Zusammenhang mit Nekrose, nämlich: Zerfall der Zellstruktur und Bruch der Plasmamembran (siehe ergänzende Abbildung S7). Sobald wir diesen Phänotyp in unseren Zellen beobachten, stufen wir sie als tot ein. Der Fehlerbalken für den Anteil toter Zellen sowie für den durchschnittlichen Zellradius wird als Standardfehler über die Gesamtzahl der analysierten Zellen berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten experimentellen Daten wurden in den 4TU-Repositories hinterlegt: Rohmikroskopie [https://doi.org/10.4121/60bea990-b1a6-40c7-9355-584e061791d5.v2] und Wachstumsraten [https://doi. org/10.4121/67e56fe8-6b54-446b-aaac-cd2e245ee066.v1]. Parametersätze für das mathematische Modell sind in GitHub [https://github.com/f-brauns/yeast-polarity-LSA] verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Mathematica-Code für die lineare Stabilitätsanalyse des mathematischen Modells und COMSOL Multiphysics-Simulationsdateien werden in GitHub [https://github.com/f-brauns/yeast-polarity-LSA] bereitgestellt. Dieses Repository enthält auch Parametersätze, die aus groß angelegten Parameterraumproben gefiltert wurden. Die zur Analyse experimenteller Daten verwendeten Matlab- und Python-Skripte werden im folgenden Github-Repository bereitgestellt [https://github.com/leilaicruz/Experimental-data-analysis-protein-copy-number-in-polarity].

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Wir danken Felix Meigel und Marit Smeets für ihre bahnbrechende experimentelle Arbeit. Wir danken Eelco Tromer für seinen Rat zur Phylogenetik. Wir danken Daniel Needleman und Andrew Goryachev für die kritische Lektüre des Manuskripts. EF dankt der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Unterstützung durch den Sonderforschungsbereich 1032 – Projekt-ID 201269156 – und den Exzellenzcluster ORIGINS im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC-2094 – 390783311. LL und LIC danken der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) für ihre Unterstützung durch einen VIDI-Zuschuss (016.Vidi.171.060). LL und WD danken der Niederländischen Organisation für Wissenschaftliche Forschung (NWO/OCW) für ihre Unterstützung im Rahmen des Gravitationsprogramms: Frontiers of Nanoscience. LL dankt für die Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Finanzhilfevereinbarung Nr. 758132).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Arnold Sommerfeld Center for Theoretical Physics and Center for NanoScience, Department of Physics, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany

Fridtjof Brauns, Jacob Halatek & Erwin Frey

Kavli-Institut für Theoretische Physik, University of California Santa Barbara, Santa Barbara, CA, 93106, USA

Fridtjof Brauns

Abteilung für Bionanowissenschaften, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Technische Universität Delft, Delft, Niederlande

Leila M. Iñigo de la Cruz, Werner K.-G. Daalman, Ilse de Bruin & Liedewij Laan

Max-Planck-Schule Matter to Life, Hofgartenstraße 8, D-80539, München, Deutschland

Erwin Frey

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Von FB, LIC, WD, JH, LL und EF konzipierte Forschung; FB, JH und EF entwarfen die theoretischen Modelle und führten die mathematischen Analysen durch; LIC, WD sowie IB und LL haben die Experimente entworfen und durchgeführt; FB, LIC, WD, LL und EF haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Liedewij Laan oder Erwin Frey.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Brauns, F., Iñigo de la Cruz, LM, Daalman, W.KG. et al. Redundanz und die Rolle der Proteinkopienzahlen in der Zellpolarisationsmaschinerie von Keimhefe. Nat Commun 14, 6504 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42100-0

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Eingegangen: 5. Februar 2022

Angenommen: 26. September 2023

Veröffentlicht: 16. Oktober 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-42100-0

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